標識キットに関するよくある質問と回答
Q1:低分子色素標識キットで標識可能な抗体やタンパク質の種類は？
A:種類の異なる生物種由来の汎用的なIgG抗体は標識可能です。IgM抗体については、色素使用量または標識バッファーを適切に調整することで標識可能です。IgY、IgD、IgAなどその他の抗体タイプについては検証されていませんが、抗体またはタンパク質上に遊離の第一級アミノ基が存在する限り、理論的に標識可能です。
Q2:標識対象物に関する留意点は？
A:標識対象物には遊離の第一級アミノ基またはN末端が必須です。サンプル中にTris、グリセロール、タンパク質、またはアミノ基を有する試薬が含まれてはなりません。
Q3:少量または微量の標識（例：抗体タンパク質10μg未満）は可能か？
A:現在のマニュアル記載の方法は、0.02～2mgの抗体標識用です。少量の標識を必要とする場合、カスタマイズまたは標識サービスを提供できます。また、将来的には抗体タンパク質10μg未満の標識用キットを発売する予定です。
Q4:葉酸/ペプチドなどの物質を本標識キットでFITC/Fluor594標識可能か？
A:物質に遊離の第一級アミノ基が存在する場合、理論的に標識可能です。タンパク質の場合、第一級アミノ基（リジン）の数を考慮する必要があります。低分子化合物の場合、アミノ基の数が標識可否を決定します。葉酸には含窒素複素環上に1つのアミノ基が存在するため、理論的にFITCまたはFluor594で標識可能です。ただし、当該アミノ基の求核性は比較的弱いため、標識効率は良好でない可能性があります。また、標識物質の分子量に応じて適切な限外ろ過チューブを精製に使用する必要があり、これについてはお客様が実験目的に基づき判断する必要があります。
Q5:ビオチン/低分子蛍光色素の標識効率（DOL）を向上させる方法は？
A:試行可能な方法は複数存在します。
1) 反応系における色素とタンパク質の比率を高める。
2) 反応系におけるタンパク質濃度を高める。
3) 反応温度と時間を適度に延長する。
4) 標的タンパク質用の標識バッファーを変更する。
Q6:標識効率が高いほど実験結果が良好になるのか？
A:いいえ。一般的に、汎用的なIgG抗体の場合、DOLが2～9の範囲であることが最適です。この範囲を超えると、実験結果は通常悪化します。具体的な実験結果は標識されるタンパク質や抗体の特性に依存するため、実際の実験結果に基づき最適なDOLを決定する必要があります。
Q7:低分子色素標識後の組換えタンパク質濃度を定量化・測定する方法は？
A:組換えタンパク質の定量化方法にはBCA法、UV吸収法、Bradford法、クマシーブリリアントブルー法、Lowry法など複数存在し、これらを用いてタンパク質濃度を測定できます。または、マニュアルに従い吸光度を測定し濃度を算出することも可能です。各方法には制限があるため、お客様は実際の状況に基づき適切な測定方案を選択できます。
Q8:ビオチン標識キットは抗体以外のタンパク質標識に使用可能か？
A:ビオチン標識キットの原理は、活性化ビオチンのエステル結合が標的物質上のアミノ基と反応し、安定なアミド結合を形成することです。また、タンパク質のN末端も標識可能です。リジンなどの第一級アミノ基を有するタンパク質であれば標識可能です。
Q9:ビオチン標識キットによるタンパク質標識の反応比率は20:1が適切か？
A:タンパク質の分子量と保有するリジンの数を考慮する必要があります。一般的に、1～5 mg/mLの濃度で標識することを推奨します。リジン数が10～15個程度の場合、1:20の比率を使用できます。リジン数が多い場合は、比率を調整する必要があります。
Q10:ビオチン標識抗体の効率を検出する方法は？
A: 当社が提供するビオチン標識キットは、多数の抗体の標識比率について最適化されています。標識抗体の回収率を考慮すると、通常80%以上です。標識する抗体の量が多いほど、回収率は高くなります。なお、ビオチン標識効率の算出方法は製造業者によって異なるため、標識効果の評価において唯一の判断基準とすべきではありません。
Q11:溶解後の活性化ビオチン/低分子蛍光色素の保存期間は？
A:活性化ビオチン/低分子蛍光色素の乾燥粉末は、開封前に-20℃で1年以上安定して保存できます。ただし、開封/溶解後は、密閉、遮光、防湿を徹底し、1週間以内に使用する必要があります。
Q12:ビオチンまたは低分子色素標識後のタンパク質は無菌か？滅菌または消毒方法は？
A:標識プロセスは通常開放系で実施されるため、標識後のタンパク質は完全に無菌になることはありません。滅菌または消毒方法は以下の通りです：
少量（例：50～500μL）の標識タンパク質の場合、真空凍結乾燥法による初期滅菌、または高速遠心分離により細菌を沈殿させ上清を回収することで、大部分の細菌を除去できます。
大量（1mL以上）の標識タンパク質の場合、針型無菌フィルターによるろ過滅菌を使用できます。
Q13:ビオチン/低分子色素によるタンパク質標識の効率を検出・算出する方法は？
A:標識効率の算出方法については、以下の複数の観点で理解できます：
1)DOL：1分子のタンパク質に標識される色素の平均個数。DOLが高いほど、標識効率は高くなります。
2)DOLと仕込み比率の比。例えば、色素とタンパク質の仕込み比率が10で最終的なDOLが5の場合、標識効率は50%となります。
3)抗体回収率：標識前後の抗体量を測定する。標識後の抗体損失が少ないほど、回収率および標識効率は高くなります。
Q14:標識抗体を4℃で保存できる期間は？
A:当社の標識保存液中で保存された標識抗体は、4℃で半年以上安定して保存できます。低分子色素標識抗体は1年以上安定して保存できます。
Q15:標識する抗体またはタンパク質の分子量に関する要求は？
A:現在提供している標識キットは、約150 kDaの抗体またはタンパク質の標識を推奨しています。お客様が他の分子量のタンパク質標識を必要とする場合、プロセスのカスタマイズと調整が可能です。ただし、一般的に推奨されるタンパク質分子量は20 kDa以上です。
Q16:標識に適さない抗体は存在するか？
A:ウシ血清アルブミン（BSA）、ゼラチン、遊離アミノ酸、またはアンモニウム塩を含有する抗体またはタンパク質は標識に適さないです。
Q17:1分子の抗体には一般的にいくつの蛍光物質が結合できるか？異なる抗体で標識される蛍光物質の数は異なるか？
A: 同一の蛍光物質で、同一の標識条件下では、各抗体に標識される蛍光物質の数は比較的差が小さく、抗体の起源またはバッファー組成に顕著な違いがある場合を除きます。通常、1分子の抗体には2～9個の蛍光物質が標識可能です。標識度（DOL）が5を超えると、輝度の上昇は微細となりますが、背景値は上昇する可能性があります。消光に耐性のある蛍光物質の場合、最大9個まで結合可能です。例外的なケースとして、特定の特殊抗体と特定の蛍光物質の組み合わせでは、10個以上または2個といった少ない数でも、良好な蛍光強度を維持できる場合があります。
Q18:標識効率DOLの検出・算出方法は？
A:精製後の色素/抗体タンパク質のモル比を測定して算出します。また、SDS-PAGE電気泳動またはSEC精製カラムを用いた測定方法も存在します。方法によって結果に若干の差異が生じる場合がありますが、一般的に差は大きくありません。
Q19:EnkiLifeの標識キットで標識後の蛍光が通常明るい理由は？
A:当社の標識キットに使用される蛍光色素は、複数の蛍光色素原料サプライヤーから選定され、厳格な品質検査を経ています。また、一部の色素原料には化学処理が施され、安定性が維持されています。
Q20:低分子蛍光色素/ビオチンとタンパク質の一般的な比率は？
A:抗体濃度が1mg/mlの場合、モル比は約1:20です。蛍光色素/ビオチンの種類によって若干の差異がありますが、一般的に10:1～30:1の範囲です。
Q21:低分子蛍光色素/ビオチンによる抗体標識の原理は、高分子タンパク質蛍光色素による標識と同じか？相違点は？
A: 低分子蛍光色素およびビオチンは、SE（スクシンイミジルエステルNHS）を利用して抗体の-NH2基と結合し、ペプチド結合に類似した構造を形成します。これは最も簡便な結合方法です。一方、高分子タンパク質蛍光色素は、マレイミド活性基を利用してチオール基（-SH）と結合します。この方法の利点は、抗体のFcフラグメントを特異的に標識し、抗原に影響を与えない点です。
Q22:抗体にグリセロールが含まれる場合、本抗体標識キットは使用可能か？
A: グリセロール含有量が20%以下であれば問題なく使用できます。含有量が高い場合、限外ろ過チューブを用いた複数回のバッファー交換により含有量を低減できます。ただし、これにより抗体の回収率に影響が生じる可能性があります。
Q23:抗体にBSAが含まれる場合、本抗体標識キットは使用可能か？
A: 高分子タンパク質蛍光色素標識キットの場合、少量のBSA（0.2%以下）は許容されます。低分子蛍光色素/ビオチン標識キットの場合、BSAの存在は標識結果に大きな影響を与えます。当社では抗体用BSA除去キットを提供しており、標識前にBSAを除去することでより良好な結果を得ることができます。
Q24:他社の標識手順ははるかに簡便なのに、貴社のキットは多くの限外ろ過ステップを要求する理由は？
A: 最適な標識結果を確保するため、当社の標識キットは通常、標識プロセスを干渉する不純物を除去するために抗体原料を処理します。標識後、一部のキットでは未反応色素が後続の検出結果に与える影響（例：背景染色の低減やin vivo応用）をさらに最小限に抑えるため、精製ステップを追加しています。お客様の抗体に干渉因子がなく、適切な濃度である場合、一部のステップは簡略化できます。標識に必要な総時間は、他社と大きな差異はありません。
Q25: 10mg以上の抗体を標識する場合、標識キットをどのように選択すべきか？
A: 大スケールと小スケールの標識プロセスは異なるため、現時点では10mg抗体用の専用標識キットを提供していません。10mgの抗体が同一種類である場合、1mgキットを10個購入するか、当社の標識サービスを検討できます。10mgの抗体が複数種類から構成される場合、必要な蛍光種類と標識コストに基づき選択できます。
 | Hansun HansunはEnkiLifeのタンパク質標識専門家であり、免疫学、標識技術、フローサイトメトリーを熟知し、高精度なタンパク質標識を専門とし、技術的な突破を支援しています。すべてのタンパク質は「見える」価値があります。 |