内部参照を選ぶための5ステップクイックガイド

内部標準選択の5ステップクイックガイド

内部標準とは、内部コントロールを指し、通常はハウスキーピング遺伝子によってコードされるタンパク質です。これらのタンパク質は、さまざまな組織や細胞で比較的一定の発現を示し、標的タンパク質の発現レベルの変化を検出する際の参照として一般的に使用されます。

ハウスキーピング抗体は実験における「ベンチマーク」として機能します。サンプル量の差を校正し、実験システムの安定性を評価するために使用されます。適切なハウスキーピング抗体を選択することは、データの信頼性を確保する上で重要なステップであり、大学の科学研究における遺伝子発現、タンパク質定量、その他関連研究において特に重要です。ハウスキーピング抗体を正しく選択するにはどうすればよいでしょうか？以下のポイントを参考にしてください。

           GAPDH ウサギモノクローナル抗体（Cat: AMRe21263）

1. サンプルの種由来

考慮すべき最初の要素は、実験サンプルの由来する種です。哺乳類の組織または細胞サンプルの場合、通常はβ-アクチン、チューブリン、GAPDH、ラミンB、PCNA、Na⁺/K⁺-ATPaseなどのタンパク質が選択されます。植物由来の実験サンプルの場合、植物アクチン、ルビスコなどを選択できます。その他の由来のサンプルに関する研究は比較的少ないため、文献報告を参照して適切なタンパク質を内部標準として選択する必要があります。

2. 標的タンパク質の分子量

ハウスキーピング抗体を選択する際には、標的タンパク質の分子量を考慮する必要があります。一般的に、標的タンパク質と内部標準タンパク質の分子量差が少なくとも5 kDaであることを確認する必要があります。例えば、標的タンパク質の分子量が40 kDaの場合、この時点でβ-アクチンとGAPDHは内部標準として適切な選択ではなく、チューブリンを代替内部標準として検討できます。

3. 内部標準タンパク質の発現レベル

選択された内部標準タンパク質は、被験サンプルで高発現している必要があります。一般的に使用される内部標準タンパク質は、ハウスキーピング遺伝子によって高発現し、細胞の発達と細胞生存能力の維持に不可欠です。

4. 標的タンパク質の局在

一般的なタンパク質の検出には、GAPDH、β-アクチン、またはβ-チューブリンが要件を満たすことができます。ただし、細胞内オルガネラタンパク質を検出する必要がある場合、対応する細胞内オルガネラ特異的な内部標準を選択する方が適切であり、これにより内部標準の精度が向上します。

5. 実験変数の影響を受けない内部標準タンパク質を選択する

a. 複数の組織または細胞サンプル間で発現レベルを比較する場合、GAPDHを内部標準として使用することが推奨されます。代謝タンパク質として、GAPDHは生体組織で比較的一定の発現を示します。一方、β-アクチンとβ-チューブリンは構造タンパク質であり、細胞構造は組織によって異なるため（これらの構造タンパク質の発現が一貫しないため、組織間/細胞間の比較には適していません）。

b. 一部の細胞では、組織低酸素症や糖尿病などの要因によりGAPDHの発現が増加する可能性があるため、内部標準としては適していません。

c. 細胞増殖に関連する実験では、c-Junは自身の発現が変動するため（発現レベルが細胞増殖状態に応じて変化する）、内部標準として使用するのに適していません。

d. アポトーシス実験では、TBPやラミンなどのタンパク質も内部標準として適していません（それらの発現はアポトーシスプロセス中にしばしば破壊されるかダウンレギュレートされます）。

e. 誘導サンプルを使用する場合や修飾抗体（リン酸化抗体など）を検出する場合には、β-アクチンやβ-チューブリンなどの構造タンパク質を内部標準として選択する必要があります。それらの発現は誘導処理や翻訳後修飾の影響を受けにくいため、安定した参照値が確保されます。

f. さまざまな分泌サンプル（血漿、乳汁、組織液など）を分析する場合、これらのサンプルには完全な細胞構造がないため、分泌タンパク質のみを内部標準として選択することができます（GAPDHやβ-アクチンなどの従来の細胞内ハウスキーピングタンパク質は分泌液中に存在しないか、非常に低いレベルで存在します）。

ウェスタンブロッティングにおけるハウスキーピング抗体の使用方法

1. 便利な標識内部標準の場合：二次抗体インキュベーションステップでHRP標識内部標準抗体を添加し、通常の実験手順に従ってください。

2. 従来の内部標準の場合：標的タンパク質の分子量が選択された内部標準タンパク質の分子量と大きく異ならない場合は、まず標的タンパク質の抗体インキュベーション、発色、検出を行います。次に、Stripバッファーを使用して膜上の抗体を洗い流し、内部標準タンパク質の抗体インキュベーション、発色、検出を再実施します。

3. 標的タンパク質と選択された内部標準タンパク質の分子量に明確な差がある場合、膜転写後に膜を事前染色することができます。Protein Markerの分子量に基づいて、膜を高分子量タンパク質用と低分子量タンパク質用の2つに切断し、内部標準タンパク質と標的タンパク質を分離します。次に、2つの膜片をそれぞれ内部標準タンパク質抗体と標的タンパク質抗体でインキュベートします。

Felicia  FeliciaはEnkiLifeの技術サポートスペシャリストで、抗体開発、最適化、ELISAアッセイの設計と応用において豊富な専門経験を持っています。彼女は、クライアントが適切な抗体製品を選択し、ELISA実験プロトコルを最適化し、プロセスで遭遇する技術的課題を解決するのを支援することに専念し、それによってライフサイエンス研究プロジェクトの順調な進行を支援しています。